2025年4月，四川农业大学草业科技学院黄琳凯教授团队在New Phytologist期刊发表了题为“Single-cell transcriptomes reveal spatiotemporal heat stress response in pearl millet leaves”的研究论文。该研究揭示了珍珠粟叶片在热胁迫下的时空响应机制，为理解植物耐热性提供了新的见解。研究团队通过单细胞转录组测序技术，构建了珍珠粟叶片在正常条件和热胁迫条件下的高分辨率单细胞图谱，涵盖了20589个高质量细胞并分类为五种细胞类型。研究发现，维管组织细胞在热胁迫下表现出最高的差异表达基因数量和热胁迫记忆基因表达水平。进一步研究表明，维管组织细胞中的热胁迫记忆基因（如UGT73C3）通过促进活性氧清除，增强了植物的耐热能力。此外，H3K4me3修饰在热胁迫记忆基因的表达调控中起着关键作用，有助于维持内质网稳态并促进珍珠粟叶片维管组织细胞的热适应。这些发现不仅揭示了珍珠粟叶片对热胁迫的响应机制，还为提高作物耐热性提供了潜在的分子靶点。

1.构建了高质量的单细胞图谱：通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）构建了珍珠粟叶片在热应激和正常生长条件下的高质量单细胞图谱，共包含了20589个高质量细胞，并分类为五种细胞类型：叶肉细胞、表皮细胞、维管组织细胞、分生细胞和束鞘细胞；

2.维管组织细胞在热胁迫下至关重要：在热胁迫条件下，维管组织细胞表现出最高的差异表达基因（DEGs）数量和热胁迫记忆基因的数量。这些细胞中的基因表达变化显著，表明维管组织细胞在植物应对热胁迫中起着关键作用；

3.热胁迫记忆基因的作用机制：通过单细胞加权基因共表达网络分析（WGCNA）结合热胁迫记忆基因UGT73C3的突变体和过表达系的表型及生理分析，即UGT73C3过表达系耐热性显著增强，表现为更高的存活率、相对含水量（RWC）、抗氧化酶活性等，研究人员揭示了热胁迫记忆基因在增强热耐受性方面的重要作用，特别是通过促进活性氧（ROS）积累的清除；

4.热适应机制的形成：文章提出了一个模型，即维管组织细胞中的H3K4me3修饰变化促进了热胁迫记忆的形成，维持内质网（ER）稳态，并促进了珍珠粟叶片对热胁迫的适应。此外，热胁迫诱导的ROS积累触发了ER应激反应和未折叠蛋白反应（UPR），进一步增强了热耐受性。

为构建珍珠粟的高质量单细胞图谱，作者分离了用于单细胞RNA测序的叶片原生质体，在最佳条件（28℃：25℃，12小时：12小时）和热应激（40℃：35℃，12小时：12小时）下生长的珍珠粟叶片中共收集了26245个细胞。在排除异常细胞后共保留了20589个高质量细胞。利用已报道的细胞标记基因，鉴定出八个簇，这些簇被分为五种细胞类型：叶肉细胞、增殖细胞、表皮细胞、束鞘细胞和维管组织细胞。在所有细胞类型中鉴定的细胞类型DEGs的功能富集分析和RNA原位杂交鉴定结果一致，这验证了细胞类型鉴定的一致性。其中叶肉细胞在光合作用途径里富集较多DEGs，而束鞘细胞则在光合碳固定途径中富集较多DEGs（图1）。

图1.珍珠粟叶单细胞图谱的可视化

基于所构建的珍珠粟叶单细胞图谱，通过联合CK和热应激数据，识别了14个细胞簇，通过对整合的单细胞数据进行降维处理，观察到热应激并未诱导新细胞簇的形成，这与大白菜叶片中的结果一致（sun et al.,2022）。作者在相同细胞类型中进行CK与热应激组间差异表达分析，CK与热应激间存在5173个单细胞DEGs，而bulk测序仅发现2034个Sim-bulk DEGs。

根据细胞类型特异性基因在热应激和CK中的表达分布，作者鉴定出在热应激下表达类型发生改变的434个基因。富集分析显示这些基因主要参与脱落酸激活的信号通路。此外，作者鉴定出在热应激条件下未发生表达变化的2800个细胞类型，这些细胞类型在对非生物刺激的反应、对含氧化合物的反应和对温度刺激的反应等GO条目中显著富集。其中HSPs和ROS相关基因在叶肉、束鞘和维管组织中都有表达。上述结果表明热应激不会改变基因对应的表达细胞类型，但是基因在热应激时会发生细胞类型特异性反应（图2）。

图2.热应激影响珍珠粟不同细胞类型的基因分布

在所有细胞类型中，维管组织细胞在热应激下表现出最高数量的DEGs。本研究结果发现内质网相关基因在维管组织中也具有最高的表达水平，这些DEGs在与维持温度稳态相关的通路中显著富集，与增强植物耐热性相关的基因包括SERK1（PMA6G05-681）、CYP72A15（PMA6G03837）和ALFIN-LIKE7/8（PMA3G05-928/PMA4G05-308）均在维管组织细胞中被上调。为深入解析维管组织细胞类型对热应激的转录响应，作者根据细胞类型标记基因及细胞相关性分析，将维管组织细胞分为发育中的木质部细胞、发育中的韧皮部细胞和原形成层细胞。集群。热应激后，细胞分化程度以及木质部和韧皮部细胞比例均显著增加，表明热应激促进了维管组织细胞的分化。

拟时序分析结果表明，1243个基因参与了木质部和韧皮部细胞分化。作者还鉴定了和应激记忆相关的基因（如WRKY33、MYB4和HSP70），它们在维管组织中表达。上述结果表明，珍珠粟叶片的维管组织细胞对热应激的特异性反应可能与热应激记忆相关（图3）。

图3.热应激对珍珠粟维管组织细胞分化的影响

为了验证上述假设，作者在珍珠粟的全基因组水平上鉴定了热应激记忆基因。作者鉴定出3%（170/5089）的DEGs，被用于评估对重复热应激的转录记忆。

通过对预热应激和对照组、热应激和对照组的DEGs的比较，共鉴定出531个热应激记忆基因。分为两大类基因：第一种类型在启动热应激后增强表达，而第二种类型在启动热应激后降低表达。第一种类型中有41个基因在启动热应激后显著上调，其中121个基因在脱落酸信号通路中富集，其余的150个基因在温度刺激响应中富集。

CUT&Tag检测结果表明，H3K4me3修饰在热应激后记忆基因的表达调控中起关键作用，如增强I型基因HSFA2B表达，降低II型基因bHLH74表达。另外结果表明，热应激记忆基因主要在维管组织细胞中发挥作用（图4）。

图4.珍珠粟热应激记忆基因的鉴定

通过基因共表达网络分析（WGCNA）揭示珍珠粟叶片热应激反应的动态模式，发现MEyellow模块和热应激下维管组织细胞呈现显著正相关，包括热应激记忆基因UGT73C3。此外在珍珠粟中，UGT73C3基因的表达受到H3K4me3修饰的调控。相较于初次热胁迫，二次热胁迫后H3K4me3修饰显著增加，表明该基因在重复热胁迫下表达上调(图5、图6)。RT-qPCR分析结果表明UGT73C3在重复热胁迫下的表达逐渐上调，这进一步支持了UGT73C3在应对热胁迫时的重要性。

作者还构建了珍珠粟的UGT73C3基因水稻过表达系（UGT73C3_OE）和突变体（ugt73c_Mut）进行了表型和生理反应评估，结果显示，在热胁迫条件下，过表达UGT73C3的植株表现出更高的存活率、相对含水量（RWC）、过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）和超氧化物歧化酶（SOD）活性，并且相对电解质渗漏率、丙二醛（MDA）含量和ROS积累较低，相比野生型（ZH11_WT）有显著改善。

另外UGT73C3主要在维管组织中表达，有助于维管发育。此外，通过对维管组织细胞的石蜡切片观察发现，UGT73C3过表达植株的韧皮部细胞数量显著增加（图5），表明其可能影响韧皮部的分化。

图5.I型记忆基因(UGT73C)的耐热功能分析

图6.珍珠粟叶片中维管组织细胞热适应形成的机制

该研究通过单细胞转录组学分析揭示了珍珠粟叶片在热胁迫下的时空响应机制。研究表明，维管组织细胞是热胁迫下最关键细胞类型，表现出最高数量的差异表达基因和热胁迫记忆基因。特别是UGT73C3基因在维管组织细胞中发挥重要作用，通过促进活性氧积累的清除来增强植物的耐热性。研究结果为理解植物耐热机制提供了新的见解，并为培育更耐热的作物奠定了基础。