根系作为植物吸收水分、矿物质及其他必需营养物质的主要器官，对植物的生长发育和环境适应性至关重要。根系结构（Root System Architecture, RSA）涵盖了一系列空间和形态特征，如根角度、特定根面积、根直径、根长密度、总根长、根分枝和根生物量，这些特征共同决定了植物的适应能力与资源获取效率。然而对于根系结构的遗传决定因素仍知之甚少。2025年9月，北京林业大学生物科学与生物技术学院张德强教授团队在《Plant Physiology》期刊上发表了题为“Integrating 3D imaging, GWAS, and single-cell transcriptome approaches to elucidate root system architecture in Populus”的文章。研究针对中国北方重要树种，通过整合3D成像、全基因组关联分析（GWAS）和单细胞转录组技术，旨在阐明杨树根系结构的遗传调控网络。对303个杨树种质资源进行了96个根系性状的GWAS分析，鉴定出PsiSKP2B作为关键候选基因，通过与PsiWOX4和PsiZHD9的相互作用，调控侧根发育。研究不仅揭示了在分生组织细胞中的表达特性和调控机制，还阐明了其通过生长素信号通路影响侧根发育的分子机制，为杨树根系改良和抗逆育种提供了重要的理论基础。

整合3D成像、GWAS和单细胞转录组方法阐明杨树根系结构

发表期刊：Plant Physiology

发表时间：2025.9

单位及作者：北京林业大学生物科学与生物技术学院张德强教授团队

1.96个根系微观表型性状的高相关性

为了探究小叶杨自然群体中根系发育的表型多样性，作者对303个不同种质的96个表型性状进行了量化分析（图1A）。在该群体中观察到了广泛的表型变异，直到40天时，其空间分布变得清晰可见（图1B）。作者采集了303个种质资源（含3个生物学重复）的多角度图像，每个种质共计24张图像（图1C-D）。利用RiaRoot软件，生成了一个包含96个根系微观表型和16个宏观表型的综合数据集。这些特征包括7个根系结构参数：com_x（根系质心相对坐标）、com_y（根系质心相对坐标y）、ellips（椭圆度）、rect（矩形度）、convexhull（凸包面积）、coord_x（表征根系形态的x坐标）以及diff_x（扩散角）。此外，还分析了9个根系形态学特征，以捕捉与水分吸收和机械稳定性相关的器官尺度性状，包括直径均值（diam_mean）、长度（length）、面积（area）、方向性（directionality）、尖端数（tip_count）、水平均值（cross_hori_ mean）、水平扫描最大值（cross_hori_max）、垂直扫描均值（cross_vert_mean）以及垂直扫描最大值（cross_vert_max ）。所选性状共同反映了根系的适应策略。例如，根系凸包面积和质心位置影响植物的锚定能力，较浅的质心值与多风环境下的抗倒伏性相关等。这些性状从多维度全面表征了根系的结构和形态特征。

相关性分析显示多个表型性状间存在高度相关性。例如， coord_x8 与 coord_x9 之间的相关系数高达0.99，表明这些性状可能受相同或密切相关的遗传调控机制支配。此外，矩形度、扩散角、椭圆度、水平均值和最大水平数这5个性状间主要呈现正相关，表明它们在根系发育过程中可能产生协同效应。例如，较高的扩散角值可能促进土壤中根系的扩展，从而增加水平根的数量和最大根数。在16个宏观表型中，观察到的最强相关性为0.99（图1E），而矩形度与椭圆度的相关性为0.98（图1E）。这些高度相关的性状可能与关键基因的共定位有关，暗示它们可能受相同或密切关联的基因调控。

图1 根表型数据采集。

2.GWAS 揭示杨树中调控RSA的关键基因

利用Illumina技术对303份小叶杨种质进行了全基因组重测序，共鉴定出639,988个SNPs，其缺失率不超过1%，次要等位基因频率（MAF）≥ 0.05。利用这些高质量的SNPs，作者对303份小叶杨种质进行了主成分分析（PCA）以确定其遗传结构。PCA结果显示，第一主成分（PC1）解释了65.1%的方差，第二主成分（PC2）解释了7.4%的方差。亲缘关系矩阵分析进一步证实了较低的遗传相关性（95.78%的亲缘关系系数 < 0.05），支持该群体适用于无显著分层偏差的全基因组关联分析。遗传结构分析、PCA和系统发育研究清晰地展示了种质之间的遗传距离，突显了该群体中存在3个主要的单系群。

利用混合线性模型（MLM）对这96个性状进行了GWAS分析。共有150个SNPs位点与这96个性状显著相关（P≤1.56 ×10 [1/n]，Bonferroni检验），其中SNP Chr5_18605247与6个性状关联。基于全基因组连锁不平衡（LD）衰减情况，在关联SNP位点的上下游2kb范围内鉴定候选基因，共鉴定到72个。且包含一些先前报道的根系发育基因，包括。值得注意的是，位于PsiSKP2B上游40bp处的SNP Chr5_18605247显示出与6个表型性状（com_x、coord_x、cross_hori_mean、diff_x、ellips和rect）的显著关联，其中与cross_hori_mean的关联最强（图2A-I）。这些发现表明可能在调节侧根发育中发挥重要作用。与这6个表型性状相关的T等位基因频率增加，而杂合等位基因频率降低，进一步表明该等位基因与观察到的表型性状之间存在强烈的遗传关联（图2J）。被普遍认为是拟南芥的直系同源物，作为F-box泛素连接酶发挥作用，从而促进细胞分裂和起始细胞分裂。此外，基因和分别显示出与ellips、coord_x和rect的显著关联（图2E、G和H）。编码的蛋白是一种茉莉酸酰胺合成酶，属于GH3蛋白家族，与光、葡萄糖和生长素信号通路相互作用，精细调节拟南芥侧根的分枝角度。编码一种Lon蛋白酶样蛋白，在LON2突变体中观察到了吲哚-3-丁酸诱导的侧根形成严重缺陷。被预测编码香叶基转移酶（GGT-IB）的β亚基，该酶参与脱落酸介导的信号通路和生长素信号通路。在细胞周期过程中受转录调控，在活跃细胞增殖区域表达，包括主根尖、茎基、侧根原基、正在伸出的侧根原基、侧根尖、幼茎、花药和子房，OsORC3敲低植株缺乏侧根。虽然这些候选基因对细胞分裂、侧根形成、分生组织发育和激素信号至关重要，但与相比，它们与多重性状的共同关联较弱，且缺乏与多重表型性状直接遗传关联的证据。

图 2 为根构型（RSA）形成的潜在基因。

3.在根中的特异性表达

为全面解析根发育过程并验证GWAS鉴定的候选基因的功能，作者对小叶杨的侧根和叶片组织进行了转录组测序，平均比对率为71.2%。差异筛选共鉴定出 9,024个差异表达基因（DEGs），其中包括4,879个下调基因和4,145个上调基因（图 2K）。对这些DEGs进行GO富集分析，在分子功能类别中，观察到与侧根形态发生、侧根发育和胚胎后根发育相关条目显著富集。通过整合GWAS和转录组数据，作者发现PsiSKP2B在根组织中特异性表达，并且显著上调（图 2K-L）。相比之下，和虽然在根中表达，但未被鉴定为DEGs，这表明这些基因可能在根发育中发挥基础性或非特异性作用（图 2K-L）。

为确定与侧根发育相关的关键因素，作者采用加权基因共表达网络分析（WGCNA）对9,024个差异表达基因（剔除极低表达或低变异系数值）进行分析。共鉴定出12个共表达模块，每个模块包含46至2,322个差异表达基因，包含在内的1,703个基因组成的棕色模块，显著富集了参与根冠发育、根系发育和根表皮细胞分化的基因（图2M）。进一步证实了与侧根发育密切关联。

为验证转录组分析结果的可靠性，作者对和进行了RT-qPCR，结果显示，仅差异表达基因的表达趋势与RNA-seq分析结果一致。收集了拟南芥中已知的SKP2蛋白序列进行系统发育分析，包括SKP2A（AtSKP2；1，AT1G21410）、SKP2B（AtSKP2；2，AT1G77000）及其他多个推定旁系同源基因（AT5G22660、AT5G44490、AT2G42720），序列相似性分析显示PsiSKP2B与SKP2A的相似度为71.6%，与SKP2B的相似度为72.2%。此外，系统发育分析表明PsiSKP2B与AT1G77000在多个植物物种（拟南芥、中粒咖啡、辣椒、马铃薯、水稻）中同属一个进化支，证实了它们的直系同源关系。

4.单细胞转录组分析揭示细胞的异质性

为阐明在侧根发育过程中的细胞类型特异性表达模式，作者分离了“无侧根”和“有侧根”杨树根尖的原生质体进行了单细胞RNA测序，最终保留10,000个细胞用于分析（图3A）。结果显示，比对率为76.6%，无侧根样本共捕获9,090个细胞，每个细胞检测到的基因中位数为1,508个，有侧根样本捕获12,414个细胞，每个细胞检测到的基因中位数为1,319个。

UMAP或t-SNE将细胞划分为12个不同的簇，通过分析已知细胞类型标记基因的同源物，对12个细胞簇中的细胞类型进行了评估。成功鉴定出8种主要的根尖细胞类型：无毛细胞（簇0和簇4）、中柱细胞（簇1）、皮层细胞（簇2和簇5）、侧根冠细胞（簇3和簇6）、中央根冠细胞（簇7）、内皮层细胞（簇8和簇10）、分生细胞（簇9）以及成毛体细胞（簇11）（图3B）。在已识别的细胞类型中，无毛细胞和皮层细胞数量尤为丰富，分别占总细胞数的32.2%和22.1%。此外，基因表达分析显示，在较大的细胞类型簇中，无侧根样本与有侧根样本之间存在显著的基因表达重叠，包括无毛细胞（78.1%）、内皮层细胞（67.6%）、中柱细胞（61.5%）和分生细胞（55.4%）。相比之下，成毛体细胞中比例最低（23.8%），这与该细胞类型在不同根条件间观察到的显著形态分化相一致。

图3 杨树根尖单细胞图谱及PsiSKP2B的表达定位。

5.各细胞类型中GWAS鉴定的候选基因特征分析

在本研究中，GWAS鉴定出的72个候选基因中有57个在根系的不同细胞类型中显著表达（图3C）。进一步研究了与侧根发育相关基因的表达模式，包括和（图3D）。这些基因表现出明显的细胞特异性表达谱，凸显了它们在根系发育中的精细作用。例如，在中央根冠、皮层、内皮层、侧根冠、分生和成毛体等多种细胞类型中大量表达（图3D）。尤其是在有侧根样本中的皮层中表达最为显著，提示在该区域响应侧根发育中具有重要作用（图3D）。此外，和主要在分生细胞中表达，其中在有侧根的成毛体细胞中高水平表达，而在无侧根样本中几乎不表达（图3D）。与类似，和在有侧根样本中的表达水平也升高（图3D），表明它们可能在稳定生长条件下维持根系结构和功能。相比之下，和在整个根系中的表达水平极低，表明它们在根系发育中的作用可能有限，或可能依赖于特定环境或发育背景（图3D）。此外，在侧根冠中的表达仅次于其在分生细胞中的表达，表明可能参与侧根发育。

另外作者分析了细胞类型特异性标记基因（|log2FC|≥0.58且P值<0.05，相对于其他7种细胞类型）的表达模式，并通过GO富集研究了每种细胞类型中标记基因的功能。例如，侧根冠中的基因主要与外源物质刺激、多维细胞生长和真菌攻击相关。在分生细胞群中，与响应有机氮化合物和生长素相关的基因显著富集。

6在杨树中正向调控侧根发育

为探究在杨树侧根发育中的作用，作者构建了RNA干扰（RNAi）和过表达（OE）的转基因植株，筛选出PsiSKP2B表达水平最高的3个品系（OE-1、OE-9和OE-11）以及表达水平最低的3个品系（Ri-1、Ri-2和Ri-6）进行后续分析。表型观察发现过表达株系表现出显著增强的侧根生长，侧根长度、数量、密度等显著增加（图4A-E）。在11天的跟踪观察中，OE-1、OE-9和OE-11株系的侧根形成比野生型早1-2天（图4F）。为了研究对生长素水平的影响，作者对转基因株系进行了生长素定量分析。结果显示，与野生型植株相比，过表达株系的生长素水平显著升高，而PsiSKP2B-RNAi株系的生长素水平显著降低。综上所述，这些结果表明通过正向调控参与侧根发育，并且可能通过调节生长素水平来实现。

图4 正向调控杨树侧根发育。

7.结合差异表达基因（DEG）与功能相关基因（WGCNA）鉴定PsiSKP2B的互作蛋白

为探究响应侧根调控的转录调控网络，作者对PsiSKP2B-OE和PsiSKP2B-RNAi品系的杨树根系进行了RNA-seq分析（图4）。基于RT-qPCR分析中观察到的这些品系（OE-1、OE-9、Ri-1和Ri-2）的显著表达差异，后续选取了4个转基因品系进行分析。PsiSKP2B-OE与野生型植株的比较分析鉴定出232个DEGs，包括104个显著上调基因和128个显著下调基因（图5A）。PsiSKP2B-RNAi品系与野生型相比鉴定出103个DEGs，其中51个显著上调，52个显著下调（图5A）。GO富集分析显示这些差异表达基因主要与侧根形成、糖苷化合物代谢过程、碳水化合物代谢过程及发育过程等生物学过程相关（图5B），表明在调控侧根发育相关转录网络及代谢通路中起关键作用。

为鉴定调控的核心基因，作者筛选了与野生型相比，PsiSKP2B-OE和PsiSKP2B-RNAi均能产生响应的差异表达基因（图5A）。维恩图分析结果显示，有6个DEGs被PsiSKP2B-OE和PsiSKP2B-RNAi共同调控（图5A）。其中，3个DEGs（）受到正向调控，其转录水平在PsiSKP2B-OE株系中显著增强，而在PsiSKP2B-RNAi株系中较对照组明显降低（图5C）。另外3个DEGs（）的表达受到负向调控，其沉默可促进这些基因的表达（图5C）。鉴于在侧根发育中已证实的正向调控作用（图4B-F），作者聚焦于3个被正向调控的DEGs，这些基因可能代表在杨树根系中的直接靶标，为理解介导的侧根发育分子机制提供新见解。

为进一步揭示与侧根发育相关的关键因素，本研究采用WGCNA分析了PsiSKP2B-OE与野生型之间232个DEGs（剔除表达量极低及变异系数极低的基因）。其中126个相关基因被归类为一个与特异性关联的蓝绿色模块。通过聚焦连接度最高的基因（权重值前20位），构建了一个以为核心的共表达网络（图5D）。该网络突显了5个关键基因（及），这些基因参与生长素响应、铜转运及WUSCHEL相关同源框调控等多种生物学功能。单细胞转录发现这些基因主要在无毛细胞中表达（图5E）。此外，作者发现PsiSKP2B-OE显著增强了的转录水平（与对照组相比），而PsiSKP2B-RNAi则相反（图5C）。综合DEG分析与 WGCNA 结果，作者提出PsiWOX4和PsiZHD9蛋白可能分别与PsiSKP2B存在物理相互作用，在杨树根系发育过程中，和受到的正向调控，且极可能是的直接作用靶点。

图5 靶基因的预测与验证。

8.PsiSKP2B直接与PsiWOX4或PsiZHD9相互作用

为探究介导的侧根发育机制，作者需进一步确定PsiSKP2B是否与PsiWOX4或PsiZHD9存在物理相互作用。亚细胞定位实验表明，PsiWOX4和PsiZHD9定位于细胞核，这与PsiSKP2B的定位模式一致（图5F）。酵母双杂交（Y2H）实验显示，PsiWOX4和PsiZHD9可能是PsiSKP2B介导的侧根发育的潜在相互作用因子。

为验证这一假说，作者采用荧光素酶互补成像技术评估了PsiSKP2B与PsiWOX4或PsiZHD9的物理互作。在本氏烟草叶片中共表达载体后，检测到PsiSKP2B与PsiWOX4或PsiZHD9共表达结果中存在荧光素酶活性，而阴性对照则未检测到（图5H）。另外PsiSKP2B与PsiZHD9及PsiWOX4的互作关系通过免疫共沉淀（co-IP）实验进一步证实。综合体内与体外实验结果表明，PsiSKP2B确实与PsiWOX4和PsiZHD9存在物理互作。

为验证PsiWOX4和PsiZHD9是否为PsiSKP2B的泛素化底物，作者在瞬时表达本氏烟草叶片中检测了PsiZHD9和PsiWOX4蛋白的体内泛素化水平。在PsiSKP2B-GFP存在时，观察到PsiZHD9和PsiWOX4被PsiSKP2B泛素化。此外，添加蛋白酶体抑制剂MG132进一步降低了蛋白提取物中PsiZHD9-Flag或PsiWOX4-Flag的降解速率。这些结果证实PsiSKP2B特异性参与PsiZHD9和PsiWOX4蛋白的降解过程。

此外，PsiSKP2B主要在分生细胞中表达，而PsiWOX4和PsiZHD9主要在无毛细胞中表达（图5E）。为验证这些候选基因在体内的表达模式，作者进行了原位杂交实验，并成功鉴定出杨树根细胞类型的标记基因。例如，Psi03G016300特异性表达于分生细胞，Psi14G013520则特异性表达于无毛细胞，与单细胞注释注释结果一致。此外，作者利用各自标记基因对8种主要细胞类型进行了 UMAP 图可视化，结合原位杂交与标记基因可视化显著提升了细胞类型注释的可靠性。